作者：杨莉, 李琳洁, 邓子牛
作者单位：湖南农业大学
摘要：随着转基因研究的不断深入及转基因植物的商品化，标记基因滞留在植物体内的不利影响逐渐暴露出来。除了对植物体发育和目标基因表达的消极影响外，标记基因最令人注目的方面还在于其潜在的“流动”——基因的水平转移与基因逃逸可能产生的生物安全性问题。此外，选择标记基因之间相互排斥及标记基因堆积会加大同源性基因沉默可能性的问题，给利用有性杂交或再生进行多重转化的工作带来了困难。所以，如何获得无标记转基因植物己成为了转基因育种研究中的新课题。本试验采用一个化学诱导剔除载体进行无标记转基因研究，它由基于雌激素受体的类固醇诱导系统(XVE系统)和Cre/LoxP位点特异性重组系统组成。通过β-雌二醇诱导表达系统控制重组酶系统Cre基因的表达，剔除标记基因。可诱导的自切除途径可简化操作步骤，控制切除时间，并无需在标记基因去除之后再经过遗传分离将重组酶基因去除，一步获得目的植株，利于无性繁殖的木本植物剔除标记基因。目前在柑橘上还未见相关报道。pX6-gfp载体由华中农业大学张余洋老师提供。在该载体中重组酶系统Cre受G10-90启动子驱动，而G10-90启动子在拟南芥具有有效的启动功能，在水稻等其他作物表现较低的驱动效应。鉴于在柑橘中CaMV35S启动子能有效的行使功能，对载体进行改造。从pBI121载体上扩增得到35S启动子，并替代原载体上的G10-90启动子。将所构建载体通过冻融法导入农杆菌EHA105感受态细胞中。并通过农杆菌介导法转化实生态甜橙外值体，共培培养基(MS培养基+3mg/L 6-BA)上暗培养3d后，转入筛选培养基(MS培养基+75mg/L Kan+500mg/L Cef)中，20d左右开始萌发不定芽。芽长度为4mm时，切下带芽外值体长为1-2mm，共5株糖橙和3株大红甜橙抗性芽转入化学诱导剂培养基(MS培养基+500mg/L头抱霉素+2µM β-雌二醇十3mg/L 6-BA)中培养，其余20株糖橙和20株大红甜橙抗性芽不进行诱导，继续在筛选培养基中培养。诱导15d后，用倒置荧光显微镜和体视荧光显微镜观察，糖橙和大红甜橙各有2株能成功观测到绿色荧光。同时，其他未进行诱导的甜橙抗性芽都没有观测到绿色荧光(图l)。现所有诱导植株、未诱导植株及未转化植株对照己通过试管嫁接于积橙上，生长良好。后期将对植株进行分子检测，了解标记基因切除及重组发生情况。
关键词：无标记, 标记基因, 转基因研究, 基因载体, 启动子, 雌二醇, 筛选培养基, 酶系统, 外值体, 植株
文献注录：杨莉, 李琳洁, 邓子牛 . 柑橘无标记基因载体的构建及转化甜橙的研究(摘要) [A]. [C] 第二届全国果树分子生物学学术研讨会. 2009.
报/刊名：《》，发表于2009
文献类型： [A]
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