作者：付行政
作者单位：华中农业大学
摘要：柑橘是世界最重要的果树之一,其产业的发展对促进地区经济和人类健康具有重要意义。在过去的十年中,柑橘生产取得了巨大进展,但是生物和非生物胁迫一直是制约柑橘生产的重要因素,其中溃疡病、盐害以及低温对柑橘产业造成的经济损失十分惨重。因此培育抗性强的柑橘品种是解决这些问题的关键。由于传统育种手段在柑橘上存在的局限性,利用基因工程技术将一些重要的抗性基因转入柑橘是获得抗性种质最为快捷高效的途径。已有研究表明,多胺在植物抗病反应中发挥重要作用,但是相关报道十分有限。甘氨酸甜菜碱是植物在高盐胁迫下积累的一种重要渗透保护物。ICE1是植物低温响应基因中最上游的一个转录因子,其调控一系列低温响应基因的表达。本研究对已经获得的亚精胺合成酶基因(MdSPDS1)转暗柳橙(Citrus sinensis Osbeck'Anliucheng')植株进行了分子鉴定以及溃疡病抗性分析,此外通过农杆菌介导的遗传转化将甜菜碱醛脱氢酶以及PtrICE1转录因子分别转入枳(Poncirus trifoliata L.Raf.)和柠檬(Citrus limon Burm.f.)中,增强其盐以及低温抗性。主要结果如下： 1.对MdSPDS1基因转暗柳橙株系进行了PCR鉴定,获得10株阳性转基因植株。MdSPDS1基因在TG4和TG9两个转基因株系中超量表达。Soutern杂交分析表明,MdSPDS1基因在TG9植株中以单拷贝插入。多胺含量测定结果表明TG4和TG9的精胺(Spm)含量明显高于WT。对TG4.TG9以及非转基因对照植株(WT)叶片接种柑橘溃疡病(Xanthomonas axonopodis pv.citri)发现,两个转基因系比WT表现明显低的敏感性、发病率和病斑大小。此外,研究数据表明接种溃疡病明显诱导了TG9中Spm积累和多胺氧化酶(PAO)活性,TG9比WT表现更显著的过敏性反应(HR)和更多的H202产生。对TG9叶片使用PAO抑制剂(双胍辛胺乙酸盐)处理明显抑制了PAO活性,减少了H202产生,和水处理对照相比导致明显严重的溃疡病发生。此外,接种前后病程相关蛋白以及JA合成相关基因在TG9中表达量显著高于WT。 对相同条件下TG9和WT叶片进行基因芯片杂交,共挑选出666个差异表达基因,其中上调表达448个,下调表达218个。随机挑选9个上调表达和1个下调表达基因使用RT-PCR方法验证了基因芯片结果。使用Blast2GO软件对所有差异基因进行了功能注释,同时按所涉及的生物学过程、分子功能和细胞元件进行了功能分类,包括细胞过程、代谢过程、对刺激响应、定位、生物学调控、结合活性、催化活性、转运活性、电子载体活性、转录调控活性、细胞器、大分子复合体、细胞外区间等。在上调表达基因中,68个对刺激响应和免疫系统过程相关基因、12个细胞壁相关基因和13个转录因子类基因可能直接涉及溃疡病抗性,本研究对其进行了讨论。此外,RT-PCR分析了一些重要候选基因在接种前后表达,结果表明大部分基因在TG9中的表达量均不同程度的高于WT,且溃疡病接种能进一步诱导其表达。 2.对枳实生苗采用0、100、200mM NaCl处理发现,盐处理明显诱导了其甘氨酸甜菜碱(GB)积累,且随盐浓度升高表现更高的积累水平。通过农杆菌介导的遗传转化将山菠菜(Atriplex hortensis)甜菜碱醛脱氢酶基因(AhBADH)转入枳中,PCR鉴定表明获得阳性转基因植株。RT-PCR分析表明AhBADH基因在3个挑选的转基因系(#48、#51和#133)中超量表达,而在WT中没有检测到表达。三个转基因系GB含量显著高于WT。200 mM NaCl处理表明,转基因系比对照表现明显少的叶片白化和脱落,以及低的丙二醛(MDA)积累、高的叶绿素含量。此外,转基因株系在盐处理后减少了Na+、Cl积累,而增加了K+吸收,从而导致较高的K/Na水平。 3.通过农杆菌介导的遗传转化将枳中克隆的ICE1转录因子基因(PtrICE1)转入柠檬并获得转基因植株。实时定量分析表明PtrICE1基因在转基因株系中正常超表达,且大部分转基因株系PtrICE1基因表达量显著高于WT。对转基因株系以及WT进行-6℃低温处理,两个转基因株系(#17和#21)表现明显的抗寒能力。低温处理下转基因植株减少了细胞死亡和超氧阴离子积累。
关键词：柑橘, 逆境, 亚精胺合成酶, 多胺氧化酶, 柑橘溃疡病, 甜菜碱醛脱氢酶, 盐, ICE1, 低温
文献注录：付行政. 农杆菌介导的MdSPDS1、AhBADH、PtrICE1基因转化柑橘及转基因植株抗性机理研究 [D]. . 2011.
报/刊名：《》，发表于2011
文献类型： [D]
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