作者：马鑫.
作者单位：西南大学
摘要：柠檬苦素类似物是引起柑橘苦味的主要原因之一,柑橘的苦味对柑橘果实的鲜食和加工品质有明显不利影响。此外,柠檬苦素类似物具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、昆虫拒食等很多药理活性。由于柠檬苦素类似物具有这些功能,所以柠檬苦素类似物的需求日益增加,但是苦味的存在限制了人们对它的摄取。柠檬苦素类似物配糖体具有水溶性且无苦味等特性,其生物学活性和柠檬苦素类似物是相似的。因而将其作为替代性食品添加剂,有很好的市场前景。 本研究在前人研究的基础上,从梁平柚中扩增出了一个柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因CmLGT。先后构建了CmLGT基因的原核表达载体和植物表达载体,研究的主要结果如下： 1.柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因CmLGT的扩增及编码蛋白性质分析 根据GenBank公布的柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物。以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过PCR方法扩增到柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因的全长编码区,并通过生物信息学方法对CmLGT基因编码蛋白的性质与结构特点进行了分析,结果显示：它编码511个氨基酸,分子量约为57.467 KD,等电点为6.01,有21个磷酸化位点,没有信号肽。CmLGT蛋白二级结构由α螺旋(helix,28.18%),延伸链(extended strand,22.11%),随机卷曲(random coil,49.71%)组成。在NCBI上对其保守结构域分析发现CmLGT基因编码的蛋白具有GT家族的特征。 2.CmLGT基因原核表达载体的构建及表达体系的优化 将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经最优条件(4 h,37℃和1.0mmol·L-1PTG)诱导表达获得大小约为62 kD的目的融合蛋白,对融合蛋白进行可溶性分析发现该融合蛋白以包涵体形式存在。 3.植物表达载体的构建 通过双酶切、连接、转化等过程将目的基因CmLGT连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,转化根癌农杆菌LBA4404,利用BamHⅠ和SacⅠ双酶切及PCR验证,表明成功构建了目的基因的植物表达载体并成功转化农杆菌LBA4404。 4.对烟草的遗传转化 应用农杆菌介导的叶盘法将含有柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶基因CmLGT的植物表达载体导入野生烟草植株中,通过抗性筛选、GUS组织化学染色以及PCR扩增检测,获得转基因烟草植株9株。
关键词：柠檬苦素类似物葡萄糖基转移酶, 克隆, 序列分析, 原核表达, 植物表达载体
文献注录：马鑫.. 柚柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及植物表达载体的构建 [D]. . 2011.
报/刊名：《》，发表于2011
文献类型： [D]
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