作者：周春丽
作者单位：西北农林科技大学
摘要：佛手，学名Citrus medica L. var. sarcodactylis，为芸香科柑桔属香椽的变种。它不仅是闻香赏果的花卉珍品，又是传统的名贵中药。我国佛手的主要栽培地区有广东、福建、四川、浙江等，其中浙江金华所产的佛手品质最为优良，为佛手中的上品。但其冬季不抗寒，造成冬季大部分佛手受冻死亡，严重影响佛手的品质和产量。随着现代生物技术的迅猛发展，基因工程为解决这一问题提供了有效的方法和途径。 本试验同时研究了农杆菌介导和基因枪两种遗传转化方法，分别探讨了两种转化方法的影响因素，优化了转化条件，初步建立了佛手农杆菌遗传转化系统，确定了影响基因枪转化效率的几个重要参数利用PCR 技术检测到外源基因(TPS)的导入，利用GUS 报告基因检测到外源基因在抗性愈伤组织中的表达。为遗传转化提供了分子生物学依据。主要结果如下: 1 以佛手叶片为外植体，筛选出适宜佛手再生的基本培养基为MT，以MT 为基本培养基，诱导愈伤组织配方:附加激素为2，4-D 1.5mg•L~(-1)，NAA 1.0 mg•L~(-1)，6-BA 0.4 mg•L~(-1)，诱导频率达98.1%，分化培养基:附加激素6-BA 5mg•L~(-1) 和IAA 0.5 mg•L~(-1)。 2 通过对叶片预培养时间、侵染时间、共培养时间、抑菌素种类和浓度、延时筛选时间、不同选择压等遗传转化影响因素的研究，建立的佛手遗传转化体系为:叶片黑暗预培养3 天，菌液浓度OD600 为0.6-0.8 的农杆菌中浸染20 分钟，在附加物为L-cys 400 mg•L~(-1)、AS 100μmol•L~(-1) 诱导愈伤组织培养基上黑暗共培养3 天，然后转移至附加物为250 mg•L~(-1) Cef、250 mg•L~(-1) Cb、400 mg•L~(-1) L-cys、AS 100μmol•L~(-1) 黑暗培养2-4 天，再进行Km 100 mg•L~(-1) 的选择压黑暗培养至抗性愈伤组织出现，转为光照条件下1-2 次的继代筛选，获得抗性芽后，进行扩繁。 3 取幼嫩叶片，用直径为1.0μm 金弹轰击叶片，在轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，真空度26 inches Hg，恢复培养时间为48 小时左右时。GUS 瞬时表达效率最高达17.8%，表达活性也最高。轰击次数对GUS 瞬时表达效率影响不明显。 4 以根癌农杆菌LBA4404 介导TPS 基因转化佛手叶片，获得抗性愈伤组织。对其进行 GUS 检测和 PCR 检测，结果显示 TPS 基因己转化到佛手中。在农杆菌介导转化中，GUS 瞬时表达效率达 5.9%，在 8 块抗性愈伤组织中有 2 块 PCR检测到 TPS 基因的存在。在基因枪转化中，GUS 瞬时效率高达 17.8%。但在抗性愈伤中未检测到 PCR 产物。
关键词：佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis；再生体系；农杆菌；基因枪；遗传转化
文献注录：周春丽. 海藻糖合酶基因转化佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis）方法的研究 [D]. . 2005.
报/刊名：《》，发表于2005
文献类型： [D]
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