作者：胡春华
作者单位：湖南农业大学
摘要：柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease)是由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的一种世界性检疫性病害，对柑橘产量及品质影响极大，严重危害着柑橘产业的健康发展。然而，到目前为止，尚无一种能根除柑橘溃疡病菌的最佳方法，柑橘品种资源中亦未发现完全抗病的品种，长期的常规育种，也没有获得抗柑橘溃疡病的优良杂种，柑橘抗溃疡病育种没有取得实质性进展。病原基因pthA是柑橘溃疡病亚洲型(A型)致病所必需的因子，其中3个核定位信号区是PthA的重要功能区，在寄主细胞内起识别定位的作用。本研究以柑橘溃疡病致病基因pthA为出发点，利用病原基因诱导植物获得抗性原理，将致病基因pthA的核定位信号NLSs构建正义和反义基因，导入柑橘感病品种甜橙中，使其过量表达失去原有功能的蛋白，或表达蛋白失去原有的时空性，或表达蛋白激活植物本身的防御系统，从而干扰病原菌的正常的生理代谢;另一方面，利用单克隆抗体和植物抗体技术，制备抗致病因子PthA核定位信号肽NLS单克隆抗体，分离出抗体基因的轻链和重链，并构建单链抗体基因ScFv，将其导入柑橘感病品种，通过在柑橘体内表达抗体蛋白，结合致病因子PthA蛋白的功能位点，阻断致病蛋白向细胞核的运输途径，从而达到抗病的目的。通过对转基因甜橙的抗性筛选和外源基因的表达分析，对进一步研究柑橘溃疡病的致病机理具有重要的理论意义。同时，选择高感病的主栽品种甜橙进行试验，获得的抗病新种质，从根本上控制柑橘溃疡病的危害，对柑橘产业意义重大。本研究取得研究结果如下: 1、从湖南省各柑橘产区感病果园分离纯化柑橘溃疡病菌株50份，并根据致病基因pthA和柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因差异序列，设计筛选出特异性引物对，通过优化PCR反应条件，利用PCR技术从质粒和基因组两方面对柑橘溃疡病进行鉴定，并利用离体接种对获得的菌样作最终鉴定，为后续试验提供了试验材料。 2、利用long-PCR和net-PCR方法，得到pthA完整的编码区并将其克隆到植物表达载体pBI121中。序列分析结果表明，克隆得到的pthA′与Genbank中的pthA(U28802)序列有99.8%的同源性。pthA′基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。 3、构建了pthA-nls正义基因和pthA-a-nls反义基因植物表达载体，利用农杆菌介导法转化甜橙实生苗，经PCR检测，成功获得了9株转pthA-nls和12株转pthA-a-nls基因甜橙转基因苗，目前转基因苗长势良好。对9株转pthA-nls基因甜橙中的生长势好的3株进行Southern杂交分析，证明pthA-nls基因已成功整合到甜橙基因组中，通过RT-PCR对这3株转基因植株进行表达分析，检测到了外源目的基因的表达。以溃疡病菌液接种转pthA-nls基因和pthA-a-nls及对照甜橙植株离体叶片，接种试验结果表明，转pthA-nls基因植株叶片对溃疡病表现出一定的抗性，而转pthA-a-nls基因植株叶片对溃疡病表现与对照一样敏感。 4、采用PCR法扩增出pthA基因末端NLSs序列，并将其克隆到原核表达载体PET32a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位点。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达重组蛋白，经Ni~(2+)-NTA纯化柱纯化得到纯化的重组蛋白，免疫Balb/c小白鼠，制备了相应的抗血清。Western blotting、ELISA鉴定结果表明，获得的抗血清可特异地结合重组蛋白亦可识别溃疡病菌PthA天然蛋白。利用抗血清与溃疡病菌混合接种离体冰糖橙叶片，发现抗血清对溃疡病的发生具有一定的拮抗作用，能推迟溃疡病菌的致病过程，且病斑比对照小，但未能达到抗病的程度。 5、制备了抗PthA-NLS重组多肽的3株单克隆抗体(McAb)，McAb能够特异性、高亲和力地与PthA-NLS多肽结合。这3株McAb可被进一步用于柑橘溃疡病的鉴定检测，并为下一步制备单链抗体的研究提供杂交瘤细胞株。 6、通过RT-PCR成功地扩增出重链可变区基因和轻链可变区基因，采用重叠延伸PCR将两个可变区基因串联，获得的单链抗体基因大小约750 bp，将其克隆到T载体和原核表达载体pET32a(+)，通过酶切和PCR鉴定均获得了约750 bp大小的条带。测序结果显示，重链可变区基因有360 bp，轻链可变区基因有342 bp，中间连接肽基因45 bp，经过IPTG诱导ScFv原核表达，获得了大小为44.5 KD的ScFv重组蛋白。 7、将ScFv基因构建到植物表达载体pBI121中，利用农杆菌介导法转化甜橙实生苗，经PCR检测，成功获得了12株转ScFv基因甜橙，利用RT-PCR分析外源基因ScFv在转基因植株中的表达，初步表明外源基因ScFv已成功转入到甜橙基因组中，并能在甜橙体内正常表达。采用离体接种对部分转ScFv基因植株进行抗性筛选，结果表明，转基因植株对溃疡病表现出一定的抗性，株系之间抗性存在着差异，其中D9可能是很有希望的抗性材料。
关键词：柑橘；溃疡病；pthA-nls基因；抗体；ScFv基因；转基因
文献注录：胡春华. pthA-nls及其ScFv基因转化柑橘获得抗溃疡病新种质的研究 [D]. . 2008.
报/刊名：《》，发表于2008
文献类型： [D]
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