作者：胡新喜
作者单位：湖南农业大学
摘要：柑橘是世界上最重要的果树之一，在我国水果产业中占据了重要的经济地位。然而，柑橘病害严重影响了柑橘的产量和品质。矮化密植栽培是实现柑橘集约化生产、降低生产管理成本和提高果实产量和品质的重要手段。果实无核化也是柑橘生产必须解决的重要问题之一。这些问题的解决有赖于柑橘的育种和栽培。但是柑橘类植物的多胚性、遗传背景复杂、童期长和单性结实的特点限制了柑橘常规育种的发展。柑橘组织培养以及建立在此基础上的遗传转化为缩短育种周期，获得抗病、矮化、无核的优质柑橘种质资源提供了新的途径。本研究以沙田柚(C. grandis (L.) Osbeck)和大红甜橙(C. sinensis (L.) Osbeck)为材料，建立了高效的再生体系；以茎段为材料，初步建立了我国大力推广的栽培品种——纽荷尔脐橙(C. sinensis Osbeck cv. Newhall)、朋娜脐橙(C. sinensis Osbeck cv. Bonanza)、冰糖橙(C. sinensis Osbeck cv. Bingtang)成年态再生体系，为成年态柑橘的遗传转化奠定了基础。利用根癌农杆菌介导的方法将矮化基因rolABC基因、无核基因iaaM基因导入到沙田柚中，将抗病基因chit42基因导入到大红甜橙中，并建立了根癌农杆菌介导的沙田柚和大红甜橙实生苗转化体系。对已获得的转phyB基因的枳橙(P. trifoliata (L) Raf.×C. sinensis (L) Osbeck)植株进行了分子生物学鉴定和生物学特性研究。本文获得的主要研究结果如下：1)研究了影响大红甜橙、沙田柚不定芽再生的主要因素。结果表明：外植体类型、培养基中生长调节剂浓度配比对不定芽的分化有显著的影响。上胚轴是大红甜橙和沙田柚再生不定芽的最佳外植体类型。上胚轴在改良的MS基本培养基中能形成不定芽，6-BA的加入有利于不定芽的再生，IAA的加入则不利于不定芽的再生。当6-BA浓度为3.0 mg/l时，大红甜橙上胚轴不定芽分化率达到96.7%，当6-BA浓度为5.0 mg/l时沙田柚上胚轴不定芽分化率达到81.5%。暗培养7d有利于外植体胚性愈伤组织的诱导和不定芽的再生。不定芽在附加1.5～2.0mg/l IBA的1/2MS培养基中均可生成不定根，大红甜橙和沙田柚的生根率分别为94.7%和57.1%，0.2%的活性炭有利于根的生长。 2)利用纽荷尔脐橙、朋娜脐橙、冰糖橙和隆园早温州蜜柑成年态茎段为材料，初步建立了再生体系。实验结果表明:田间纽荷尔脐橙、朋娜脐橙、冰糖橙节间和1年生纽荷尔脐橙嫁接苗节间和节段在附加3mg/l的培养基中均再生出不定芽;6-BA浓度影响了不定芽的再生，3.0 mg/l 6-BA的培养基中，纽荷尔脐橙节段不定芽的再生率达到了40%。 3)对影响沙田柚上胚轴转化的条件进行了研究，并利用优化的转化体系将外源基因导入到沙田柚和大红甜橙中。结果表明上胚轴在农杆菌菌液中侵染15～20min和共培养2～4d的转化频率较高;在共培养培养基中加入200μM的乙酰丁香酮有利于沙田柚上胚轴的转化，但作用不显著;黑暗中短时间的预培养有利于转化。在所有处理中，转化效率最高可达到8.25%。PCR的结果表明rolABC基因、iaaM基因成功地整合到沙田柚的基因组中。采用同样的方法将chit42导入到大红甜橙的基因组中。在转化中共获得31株转iaaM基因沙田柚植株，9株转rolABC基因沙田柚植株和3株转chit42基因大红甜橙植株。 4)对已获得的转phyB基因枳橙进行分子检测和生物学特性研究。PCR、RT-PCR和PCR Southern杂交结果表明，phyB基因已经整合到枳橙的基因组，并得到了转录水平的表达；转phyB基因枳橙表现出植株矮化、分枝角度加大、叶片变小，比叶干重增加；叶绿素含量比对照高29.1%；用Li-6400便携式光合分析系统测定枳橙叶片光合特性，结果表明转phyB基因枳橙光合作用增强，其净光合速率对有效辐射强度和CO2浓度响应值明显高于对照，对强光和高浓度CO2的利用能力明显高于对照；利用高效液相色谱法测定转phyB基因枳橙叶片的内源激素含量，结果表明其GA1、GA4、ABA、Z分别比对照高32.7%、50%、121%和17.8%，而IAA的含量比对照低，生长类激素与抑制类激素的比值差异显著，(GA1+GA4)/ABA，Z/ABA分别比对照低38.4%和43.2%；光学显微镜、透射电镜和扫描电镜观察结果表明，转phyB基因枳橙叶片栅栏组织细胞内的叶绿体数目增加，叶脉韧皮部面积加大，气孔大小也发生了变化，叶绿体基粒数和淀粉粒数分别比对照增加了25.9%和90%。嫁接试验结果表明，嫁接到转基因枳橙中间砧上的沙田柚和大红甜橙接穗萌发和生长状况良好，比对照萌发早，早期生长速度快。从这些研究结果可以推测，转phyB基因枳橙在感受红光的诱导后，活化的光敏色素B能促进叶绿素a/b结合蛋白基因(CAB)等一系列基因的表达，叶片叶绿素含量增加，叶绿体结构发生了变化，内源激素的含量和平衡关系也发生了改变，表现出光合作用增强和矮化的特征。
关键词：柑橘；再生；遗传转化；生物学特性
文献注录：胡新喜. 柑橘转基因研究及转phyB基因枳橙的综合鉴定 [D]. . 2007.
报/刊名：《》，发表于2007
文献类型： [D]
页码：第 页 / 共 页