作者：彭爱红
作者单位：西南大学
摘要： 柑桔是世界上最重要的果树树种之一，目前全世界柑桔种植面积1亿余亩，年总产1亿吨以上，柑桔年贸易额近70亿美元。柑桔也是我国最大宗的水果，2004年栽培面积2441万亩，居世界首位，总产量1496万吨，仅次于巴西、美国居第三位，产值150余亿元。柑桔业现已成为我国南方广大山区农村经济支柱产业之一，在农民致富奔小康、山区水土保持和三峡库区移民安置中发挥了重要作用。
世界各国在发展柑桔生产的同时，也始终注重柑桔品种的质量和改良，尤其是象中国这样的发展中国家，柑桔的消费结构正在发生质的转变，由通常的卖方市场转向买方市场，消费趋向于高档次、高品质和多样化，从而为柑桔品种改良提出了更多、更高、更新的要求。
然而，由于柑桔类果树童期长，遗传背景高度杂合、基因间紧密连锁、珠心胚和嵌合体的干扰以及某些品种间有性不亲和等，使得常规育种的育种周期长、育种效率低，难以满足现代柑桔业品种更新的需求。近年来，植物基因工程的迅速发展为柑桔品种改良开辟了一条新途径，使短期内进行柑桔品种的定向改良成为可能。柑桔遗传转化研究始于20世纪80年代，到目前为止已有不少报道，但就现有的报道中，在外植体的选择上，主要是采用实生苗的上胚轴、茎段等童质材料，这对于改良某些无核品种（如不知火）来说，受到了很大的限制，同时对于改良某些有核品种来说，其生产应用要经过很长的童期。以柑桔成年树腋芽为外植体材料则可以解决这一问题。
甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒（HAV）引起的一种传染病。甲型肝炎患者、亚临床感染者是甲型肝炎的主要传染源。人对HAV普遍易感，感染后可获得持久的免疫力。长期实践证实，一般隔离预防措施对甲肝难以见效，较长时期内预防甲肝的暴发或流行任务仍十分艰巨，因此，疫苗的使用是甲肝防治的根本出路。
随着近年来植物生物技术的飞速发展，为利用转基因植物生产可食（饲）疫苗的研究和应用开辟了新天地。目前，国内外已有100多种外源蛋白或多肽在植物中成功表达，而利用香蕉、番茄表达抗原的人用疫苗和运用动物饲料如马铃薯、苜蓿、烟草、谷物类等植物表达的兽用疫苗以其独特的优势，成为疫苗研究的热点。
解放军第三军医大学成功分离、克隆了HAV衣壳蛋白融合基因，并构建了相应的真核表达载体系统；以真核细胞(中国仓鼠肾细胞，CHO)表达的HAV衣壳蛋白作为口服疫苗进行动物（小鼠）试验，获得了很好的免疫效果。因此，本论文拟以柑桔成年树腋芽作为遗传转化的起始材料，建立一个高频再生体系，通过农杆菌的介导，获得转HAV衣壳蛋白融合基因柑桔材料。本论文的顺利完成将进一步完善通过转基因方法培育柑桔新品种的技术体系，同时为食用‘甲肝疫苗型’转基因柑桔筛选奠定材料基础。
主要工作和研究结果如下：
1.柑桔成年树腋芽的试管嫁接
通过柑桔田间成年树枝条不同成熟度和消毒时间对腋芽试管嫁接成活率的影响进行比较，建立了柑桔成年树腋芽试管嫁接再生的技术体系。研究结果表明，柑桔成年树腋芽的试管嫁接成活率与枝条的成熟度和消毒时间有明显的关系：消毒时间太长或太短，木质化和半木质化的枝条其腋芽的嫁接成活率都很低；木质化的枝条消毒12min左右、半木质化的枝条消毒8min左右，其腋芽嫁接成活率最高，达到80％左右。
2.建立了以柑桔成年树腋芽为受体的遗传转化方法
通过对成年树腋芽的试管嫁接、创伤以及不定芽的诱导，建立了根癌农杆菌介导的柑桔成年树腋芽的遗传转化方法。将柑桔试管嫁接苗去除顶芽并对腋芽进行完全创伤，用含有BA5mg/L和IAA2.5mg/L的农杆菌悬浮液的小棉球浸染伤口，在黑暗的条件下培养2~3d；去掉小棉球，光照条件下继续培养至不定芽长约1.0cm。将不定芽嫁接于15d龄的锦橙试管实生苗上，获得拟转化植株。
3.转基因植株的分子检测
根据Primer 3 设计一对特异引物，提取拟转化植株的DNA，以质粒为阳性对照，进行PCR扩增，得到PCR阳性植株。提取PCR阳性植株以及质粒的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行回收测序，结果显示PCR阳性植株的扩增产物为目的基因片断。因而从分子水平证明已将HAV衣壳蛋白融合基因整合到柑桔基因组中。
关键词：HAV衣壳蛋白融合基因；柑桔；转化；成年树腋芽
文献注录：彭爱红. 根癌农杆菌介导甲型肝炎病毒（HAV）衣壳蛋白融合基因转化柑桔的研究 [D]. . 2006.
报/刊名：《》，发表于2006
文献类型： [D]
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