作者：严佳文
作者单位：湖南农业大学
摘要：柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease)是一种世界检疫性病害，对柑橘产量及品质影响极大，严重危害着柑橘产业的健康发展。胡春华等利用病原基因诱导植物获得抗性原理，将致病基因pthA的核定位信号序列构建正义(pthA-nls)和反义(pthA-a-nls)基因，导入柑橘感病品种甜橙，并已获得转pthA基因甜橙株系。本试验旨在对获得的转化苗进行全面的分子鉴定，明确各株系中目的基因的整合情况和具体拷贝数，并证实目的基因可以正常表达，进而应用定量PCR分析pthA基因在各转基因株系接种溃疡病菌前后的表达情况，为pthA基因的表达量与转基因甜橙抗病性之间关系的探讨提供依据。主要研究结果如下： 1、对转pthA-nls基因糖橙、冰糖橙以及转pthA-a-nls基因糖橙进行了系统的分子鉴定，PCR结果表明pthA-nls基因成功导入到6个糖橙株系(T1-T6)和6个冰糖橙株系(B3-B8)， pthA-a-nls基因成功导入到9个糖橙株系(Tal-Ta9); Southern blot分析确定，株系T1、T2、T4、B3、B4、B5、B6、B7、Ta5、Ta8为单拷贝，株系T3、T6、B8为双拷贝，株系T5为3拷贝；RT-PCR证明两个目的基因在各阳性株系中均能正常表达； 2、建立了柑橘定量PCR分析的技术体系，从众多看家基因(Housekeeping Gene)中筛选出的18srRNA、ACTB及rpⅡ三个看家基因作为柑橘定量PCR分析的内参基因(reference gene)。这三个内参基因同时用于定量分析进行数据归一化处理，将有助于得到更可靠的数据和更客观的结果； 3、应用定量PCR分析转pthA-nls基因糖橙、冰糖橙的全部株系以及转pthA-a-nls基因糖橙的Ta5、Ta8三个株系，明确了目的基因在不同株系中的表达情况； 4、对转pthA-nls基因糖橙、冰糖橙以及转pthA-a-nls基因糖橙进行溃疡病活体接种试验，并选取部分感病转pthA-nls基因糖橙株系(T1，T2，T3，T5)进行定量PCR分析。结果表明，pthA-nls基因的表达量显著上升，且部分转pthA-nls基因甜橙对溃疡病表现出一定程度的抗性。
关键词：柑橘；内参基因；筛选；pthA基因；甜橙；分子鉴定；表达分析
文献注录：严佳文. 柑橘内参基因筛选及转pthA基因甜橙的表达分析 [D]. . 2010.
报/刊名：《》，发表于2010
文献类型： [D]
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