作者：杨莉
作者单位：浙江大学
摘要：金柑(Fortunella crassifolia Single)为芸香科柑桔亚科金柑属植物，原产中国。与其他柑桔类植物相比，金柑童期较短，实生繁殖后约2-3年便可开花结实，是用作研究果实性状或利用转基因体系研究基因功能的较理想的多年生木本植物材料。 本研究以我国金柑主栽品种‘金弹'为试材，建立了高效的再生体系、遗传转化体系和检测技术体系，获得了转BCH反义基因及叶绿素酶基因启动子的转基因植株，并对转基因材料进行了分子鉴定。主要研究结果如下。 (一) 金柑高效再生体系的建立 以‘金弹'成熟种子为试材，研究不同外植体类型及放置方式、激素配比、糖浓度等因素对不定芽或根再生的影响，建立一套高效稳定的组织培养再生体系。结果表明:上胚轴为最佳外植体，其再生不定芽频率为68%，下胚轴和子叶的不定芽再生频率均低于10%;外植体在培养基中的放置方式以形态学上端向上最好，不定芽的再生频率高出平放一倍以上;上胚轴在诱导不定芽的最佳培养基中，每外植体再生不定芽数可高达1.48个，且出芽时间相对较早，生长健壮，无玻璃化现象;培养基中蔗糖浓度为25 gL~(-1)时最有利于不定芽再生，随蔗糖浓度提高，不定芽再生频率降低，而不能分化的愈伤组织大大增加;再生芽在最佳生根培养基中生根30 d可再生3-5条不定根，平均根长度达1.8 cm;长成的完整植株在移苗以前需经7 d以上时间炼苗，直接移栽易导致再生植株萎蔫死亡。 (二) 金柑遗传转化体系的建立 建立了一套基于Kan筛选的遗传转化体系:以培养约40 d无菌苗的上胚轴为外植体;将刻伤的上胚轴在已稀释至OD值为0.5的农杆菌菌液中浸泡30 min，接种到不含抗生素的培养基中共培养3-4 d;共培养后的外植体先转移至Kan浓度较低的培养基(25 mg L~(-1))中筛选1个月，再继代到Kan浓度较高的培养基(50-100 mg L~(-1))中筛选;4-5个月后，将长至0.5-1.0 cm的抗性芽嫁接到本砧上，嫁接成活后再移至光照培养箱及温室培养，最终转化率平均为3.5%。(三)转基因检测体系的建立1.应用MPCR方法早期检测转基因抗性芽和植株以筛选标记基因nptⅡ，植物内标基因ACS和农杆菌特有基因ChvA为检测对象，对PCR反应体系退火和延伸温度、引物浓度及引物间浓度配比、缓冲液浓度、Mg2+/dNTPs浓度平衡及模板用量等因素开展研究，分别建立了以NPTⅡ/ACS基因对、NPTⅡ/ChvA基因对的转基因植物MPCR检测体系。结果表明，所建立的两套MPCR检测体系能有效地对抗性植株进行早期转基因检测，并降低了PCR检测转基因时出现假阳性和假阴性的机率。2.应用-TDNA侧翼序列分析早期鉴定转基因植株建立了早期鉴定转基因植株的下DNA侧翼序列法，该法只需少量植物材料(30mg-100mg)。采用该法成功地对20株金柑抗性芽进行分子鉴定，其中15株有外源基因的插入，部分植株还检测到多拷贝插入。表明该法不仅可对抗性植株进行转基因早期快速鉴定，同时还能检测转基因拷贝数，为植物转基因早期鉴定的理想手段。(四)遗传转化体系的应用1.应用转基因技术研究β胡萝卜素经化酶基因功能 将甜橙β-胡萝卜素经化酶(BCH)反义导入金柑，获13株转基因植株，转基因对类胡萝卜素积累效应的研究正在进行中。2.应用转基因技术研究叶绿素酶基因启动子功能分离了甜橙叶绿素酶基因启动子，并用以替换pBI121上的35CaMV启动子，构建了植物表达载体并导入金柑中，共获得9株转基因植株。对启动子表达特性的后续研究也正在进行中。
关键词：金柑, 再生体系, 遗传转化, MPCR检测, T-DNA侧翼序列分析, 甜橙BCH反义基因, 甜橙叶绿素酶基因启动子
文献注录：杨莉. 金柑遗传转化体系的建立与应用 [D]. . 2006.
报/刊名：《》，发表于2006
文献类型： [D]
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