作者：谢玉明
作者单位：湖南农业大学
摘要：柑橘是世界第一大水果，年产量超过1.1亿吨，中国是柑橘生产大国(面积第一，产量第二)。世界各国都非常重视柑橘的新品种选育，常规方法的选育中种工作一直在开展，并不断获得新的推广品种。但是，由于柑橘自身的一些生物学特性，如实生苗童期长，遗传背景复杂，杂合程度高，具有多胚性等的影响，常规育种常遇到一些障碍，影响育种进程。随着现代生物技术的迅速发展和遗传转化技术的日益完善，将外源基因导入到柑橘中，定向改良现有品种的目标性状，可为柑橘品种改良提供新的途径。 本研究以湖南省主栽柑橘品种及主要砧木品种为研究对象，建立了溆浦甜橙、冰糖橙、辛女椪柑和枳的幼年态材料离体再生体系，以及冰糖橙、纽荷尔脐橙、辛女椪柑成年态节间茎段离体再生体系。采用根癌农杆菌介导的方法，将抗病基因chit42和光敏色素基因phyB导入以上受体材料中，建立了柑橘幼年态和成年态材料的遗传转化体系，获得了一批转化植株，从分子水平、外源基因表达和转化植株生物学特性等方面进行了研究，主要研究结果如下: 1、柑橘幼年态材料离体再生体系的建立 本研究对溆浦甜橙实生苗上胚轴离体再生系统进行系统研究，筛选出适宜的不定芽诱导培养基(MT+3mg/L 6-BA)、不定芽增殖培养基(MT+1.5g/L麦芽提取物+0.5 mg/L 6-BA)和生根培养基(MT+0.5 mg/L IBA)。冰糖橙、辛女椪柑及枳实生苗上胚轴在以上培养基上均能实现高效再生。 2、柑橘幼年态材料遗传转化体系的建立 利用农杆菌介导法把chit42基因转入到溆浦甜橙中，详细研究了实生苗遗传转化体系的影响因素，对比分析外植体年龄、农杆菌侵染时间、共培培养基及pH值、共培养时间、外源目的基因等对转化结果的影响，结果表明，30d苗龄上胚轴切段经农杆菌液侵染20min后，转移到共培养基(MT+3mg/L6-BA)中暗培养3d，再转入筛选培养基(MT+3mg/L6-BA+100 mg/L Kan+500mg/L cef)中进行选择培养，抗性芽诱导率可高达27.8%，抗性芽通过茎尖嫁接可实现植株再生。同时，利用类似方法，把chit42基因转入到冰糖橙和椪柑中;把phyB基因导入溆浦甜橙和枳中，共获得了16个转基因株系，已繁育了235株转化植株。 3、柑橘成年态节间茎段的离体再生及遗传转化体系建立 以纽荷尔脐橙、冰糖橙、辛女椪柑的成年态节间茎段为材料，摸索了节间茎段离体再生体系的影响因素，结果表明，适宜于纽荷尔脐橙和冰糖橙节间茎段不定芽再生的培养基为MS+3mg/L 6-BA;辛女椪柑节间茎段不定芽再生相对较困难，适宜其再生的培养基为MS+1mg/LBA+0.5mg/LNAA。 建立了柑橘成年态节间茎段的遗传转化体系，在温室中取半木质化的成年态柑橘枝条，采用改良的预处理灭菌方法F，农杆菌菌液侵染20min，转移到共培养基(MS+1mg/L 2iP+2mg/L IAA+0.5mg/L 2，4-D)上暗培养3d，然后再在筛选培养基(MS+1mg/L BA+30mg/L Kan+500mg/L cef)上进行培养，1个月后获得抗性芽，通过试管茎尖嫁接后获得再生植株。同时，利用类似方法，把chit42基因导入到纽荷尔脐橙、冰糖橙、辛女椪柑中，共获得转化植株15株。 4、转phyB基因枳的分子鉴定及生物学特性研究 农杆菌侵染后，共获得27株抗性枳再生植株，通过PCR检测后发现其中有5株扩增出phyB基因的特异目的带;RT-PCR分析表明phyB基因在phyB3，phyB4株系枳基因组中能够表达。 利用Li-6400光合测定仪对转基因枳进行光合特性测定，结果显示转基因枳光合效率强于对照。此外，转化的枳植株在株高、节间长度、叶面积都比对照小，而叶片着生角度明显增宽。 5、转chit42基因柑橘的分子鉴定及抗病鉴定研究 利用PCR、Southern杂交、RT-PCR技术对转chit42基因成年态柠檬和幼年态溆浦甜橙进行了分子检测。PCR和Southern杂交分析认为外源chit42基因已整合到了柠檬和溆浦甜橙基因组中，并且在转基因柠檬SR23株系中为三个拷贝，SR24株系中为双拷贝，在溆浦甜橙中为单拷贝;RT-PCR技术研究表明外源基因能够在柑橘基因组中表达。 对转chit42基因柠檬进行活体和离体抗炭疽病试验，结果表明转基因柠檬抗炭疽病能力得到明显提高。利用半定量RT-PCR技术检测chit42基因在柠檬中的表达，认为在柠檬接种炭疽病菌处理后48 h，chit42基因表达量高于其他处理时间(24、72h)。此外，转基因植株与未转化植株在其形态特征方面无显著差异。
关键词：柑橘, 农杆菌介导, 遗传转化, chit42基因, phyB基因
文献注录：谢玉明. 柑橘遗传转化体系的建立及chit42和phyB基因的导入 [D]. . 2007.
报/刊名：《》，发表于2007
文献类型： [D]
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