作者：闫虎斌
作者单位：西南大学
摘要： 柑桔衰退病毒是归类于长线性病毒科(Closteroviridae)长线性病毒属(Closterovirus)的一种正义链单分体RNA病毒，主要通过蚜虫和嫁接传播，长期以来对世界柑桔产业构成严重威胁。CTV主要危害以酸橙作砧本的大多数柑桔品种以及影响嫁接在其它砧本上的柚类、葡萄柚和部分甜橙的正常生长。 本实验是基于RNAi/PTGS亦即RNA沉默技术原理，用柑桔衰退病强毒系基因组部分RNA序列，构建表达后可形成200-400bp发卡形回文结构RNA(hpRNA)的反向重复cDNA，插入由35S启动子驱动的双价载体pCAMBIA2301G中，经根癌农杆菌介导转化酸橙外殖体，再生获得转基因植株，最终目的是获得对CTV具有广泛抗性的酸橙砧木。 主要结果如下: (1)在Genebank中搜索到6条已测序的全长CTV强毒株序列，对序列比对后找出了CTV三个RNA沉默抑制因子(p23、p25和p20)的保守片段并分别设计引物(引物5'端带有拼接所需的酶切位点)，以强毒株CTV基因组混合的RNA为模板进行RT-PCR扩增出三个基因片段，经TA克隆分别接入载体pTZ57R/T中，利用载体上的T7引物与CTV特异引物对所得质粒进行PCR检测，筛选得到三个所需连接方向的克隆pTZ57Rp23、pTZ57Rp25、pTZ57Rp20。测序发现，目标序列中作为反向重复序列部分与已知6条强毒株序列同源区域的同源性在91.4%-98.6%之间。 (2)以上述二个RT-PCR产物为模板，再分别设计一对引物(引物5'端带有拼接所需的酶切位点)作巢式PCR扩增出靠近模板一端部分序列作为反向重复序列，而模版另一端未被扩增的部分被用作间隔序列(spacer)。将PCR产物插入先期构建的相应载体中，酶切检测确认得到了具有完整反向重复序列cDNA的质粒pTZ57R-hp23、pTZ57R-hp25、pTZ57R-hp20。 (3)通过酶切连接将分别位于质粒pTZS7R-hp23、pTZ57R-hp25、pTZ57R-hp20反向重复cDNA片段引入双元质粒载体pCAMBIA2301G中，替换掉载体上的GUS基因，经酶切检测确认，得到了含有反向重复序列的植物表达载体pCAMBIA2301-ctvhp25与pCAMBIA2301-ctvhp20。但是，测序发现扩增的p23基因片段中存在目的基因与双元质粒相连时所选用的酶切位点，因此原先构建好的p23片段的反向重复cDNA被切开，导致无法获得该序列的植物表达载体。将含有p20，p25反向重复序列的双元质粒转化进农杆菌EHA105中，获得含有质粒pCAMBIA2301-ctvhp25的农杆菌EHA105-ctvhp25及含有质粒pCAMBIA2301-ctvhp20的农杆菌EHA105-ctvhp20。 (4)将试管培养的意大利酸橙实生苗上胚轴切割成约1 cm长的茎段，用农杆菌EHA105-ctvhp25及农杆菌EHA105-ctvhp20对其分别侵染，茎段经过三天共培养及约三个月的选择培养，获得了一些可用于温室嫁接的卡那霉素抗性芽(着有3-5片叶子)。目前，已有部分抗性芽被接到了枳壳砧木上，正在温室中继续培养。转基因植株中转基因的表达和CTV沉默效果有待进一步检验。
关键词：柑桔衰退病毒, 转录后的基因沉默, 反向重复, cDNA, RNA, 沉默抑制因子, 植物转基因
文献注录：闫虎斌. 柑桔衰退病RNAi/PTGS载体的构建及转化酸橙研究 [D]. . 2008.
报/刊名：《》，发表于2008
文献类型： [D]
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