作者：阳佳位
作者单位：西南大学/中国农业科学院柑桔研究所
摘要：柑橘产业是我国南方农村的重要支柱产业，而每年由柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus， CTV)造成的经济损失巨大。柑橘衰退病病毒属于正义单链RNA病毒。由于利用RNAi技术进行抗植物RNA病毒已有大量成功的报道，所以应用RNAi原理进行抗CTV育种可能成为解决CTV防治的有效方法。 RNA病毒侵染植物时，一般表达沉默抑制因子使宿主植物细胞中RNAi机制钝化从而达到成功侵染植物的目的。因此阻断病毒的沉默抑制因子的表达将有助于植物抵抗病毒的侵染，从而达到抗病毒的效果。本试验将CTV中三个沉默抑制因子p25、p20和p23作为RNAi靶标序列，目的是要获得对柑橘CTV有广谱抗性的柑橘品种。 (1)RNAi载体的构建、转化和转基因植株的验证 根据CTV基因组RNA中的沉默抑制因子p25、p20和p23的序列保守区域设计引物，经RT-PCR成功克隆相关基因片段。利用重叠延伸PCR拼接法(Gene Splicing by Overlap Extension， SOE)拼接PCR产物，获得两条多基因大片段P2520、P252023。 为了便于克隆操作，在正向片段下游引物末端加上限制性内切酶BglⅡ识别序列；在巢式PCR上游引物末端加上KpnⅠ识别序列，下游引物加上BglⅡ识别序列，经TA克隆得到含两个沉默抑制因子pe5和p20基因片段的反向重复序列载体pTZ57R-HP2520。应用同样的方法得到含三个沉默抑制因子pe5，p20和p23基因片段的反向重复序列载体pTZ57R-HP252023。 载体pTZ57R-HP2520与pCAMBIA-2301G经SacⅠ和BamHⅠ双酶切，胶回收目的片段后用T4-DNA连接酶连接两个片段，然后转入大肠杆菌DH5α中，提取质粒后用Sad和BamHⅠ双酶切检测目的片段。然后将此质粒转化入农杆菌LBA4404菌株。 含有质粒pCAMBIA2301-HP2520的农杆菌被用来与锦橙上胚轴共培养获得转基因植株。本试验共获得了抗性不定芽20个，嫁接后再生成活7株，利用T-DNA区域内的GUS基因特异引物PCR检测6株为阳性，同时用NPTⅡ基因特异引物PCR检测7株为阳性。 应用同样的方法获得RNAi双元质粒表达载体pCAMBIA2301-HP252023，农杆菌介导转化锦橙上胚轴后诱导获得抗性不定芽1个，嫁接再生成活1株，经特异引物检测发现GUS基因和NPTⅡ基因均为阳性。 (2) pCAMBIA2301-HP20转基因酸橙植株的评价 分两步对本实验室已经构建好的针对沉默抑制因子p20的单基因片段RNAi (pCAMBIA2301-HP20)转基因酸橙植株进行评价。首先，8株转基因植株经过GUS组织化学染色鉴定和针对p20基因的特异引物PCR检测，证实所有的转基因植株都成功的转入了目的片段。其次，将转基因植株嫁接备份后做攻毒试验，即对其中5株转基因植株嫁接接种CTV强毒系TRL514。分别在接毒30d、50d和60d后用RT-PCR检测CTV存在情况，结果发现对照植株和其中两个转基因植株中的检查结果呈阳性，其余三株转基因植株迄今为止没有检测出CTV病毒RNA。不过，这三株未检测到CTV的转基因植株还需要再次进行攻毒试验，因此，它们是否真正对CTV具有持续稳定的抗性还需要进一步的研究。
关键词：柑橘CTV病毒, RNA干扰, 反向重复cDNA, RNA沉默抑制子, 抗病毒育种
文献注录：阳佳位. 柑橘衰退病RNAi载体构建、遗传转化与转基因植株的评价 [D]. . 2010.
报/刊名：《》，发表于2010
文献类型： [D]
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