作者：黄家权
作者单位：华中农业大学
摘要：柑橘是世界上最重要的果树之一，在我国水果产业中占据了重要的经济地位。然而，周期性的冻害严重影响了柑橘的产量和品质，这个问题的解决有赖于柑橘的抗寒育种和抗寒栽培。柑橘类植物的多胚性、遗传背景复杂、童期长、单性结实的特点限制了柑橘常规育种的发展。柑橘组织培养以及建立在此基础上的遗传转化为缩短育种周期、获得抗寒、优质柑橘种质资源提供了新的途径。 本实验以冷敏感的尤力克柠檬(Citrus limon (L.) Burm. f. cv. Eureka)上胚轴为材料，建立了高效的再生体系;以田间茎段为材料，建立了我国大力推广的栽培品种——纽荷尔脐橙(C. sinensis (L.) Osbeck cv. Newhall)的成年态组织培养体系，为成年态柑橘的遗传转化打下了基础。利用从拟南芥中克隆的ICE1基因构建了植物表达载体，并通过根癌农杆菌介导的方法将该基因导入了尤力克柠檬中，初步建立了根癌农杆菌介导的柠檬实生苗转化体系。 主要研究结果如下: 1)研究了影响柠檬(C. limon (L.) Burm. f. cv. Eureka)不定芽再生的主要因素。结果表明:外植体类型，培养基中生长调节剂浓度配比，暗培养时间对柠檬不定芽的再生有显著的影响。上胚轴是再生不定芽的最佳外植体类型。上胚轴在基本培养基中能形成不定芽，BAP和NAA的加入则有利于不定芽的再生。当BAP和NAA浓度分别为1.0和0.1 mg L(-1)时，上胚轴不定芽分化率达到76.6%，此时不定芽数也达到最高，为9.25个。暗培养20 d有利于不定芽数的提高，最高达到每个上胚轴13.46个。不定梢在附加IBA或NAA的MT培养基中均可生成不定根。IBA有利于不定根的伸长，NAA有利于不定根数量的增加。 2)利用纽荷尔脐橙(C. sinensis (L.) Osbeck cv. Newhall)田间成年态茎段为材料，建立了高效的植株再生体系。实验结果表明:纽荷尔脐橙节段以及节间茎段均可通过器官发生途径再生不定芽。光照条件和植物生长调节剂的组合影响了不定芽的再生，在1.0 mg L(-1) BAP和0.5 mg L(-1) NAA的培养基中，15 d暗培养有利于不定芽的再生，此时节间茎段不定芽的再生率达到了85.2%，平均每个外植体上产生了3.7个不定芽。伸长的不定芽在附加0.5或1.0 mg L(-1)NAA的1/2MT生根培养基中生根并移栽成活。 3)根据GeneBank中已验证功能的甘油酸酰基转移酶(GPAT)基因序列以及类GPAT基因的Expression sequence tag(EST)设计一对兼并引物，扩增出了一条长约500 bp的片段，生物信息学分析表明该片段和已知的GPAT基因序列以及类GPAT基因没有明显的相似性，说明扩增的序列非目的片段。在文中对出现这种情况的可能原因作了探讨，并提出了初步解决方案。根据GeneBank中己发表的拟南芥ICE1基因的cDNA序列设计一对引物，通过RT-PCR从拟南芥中扩增得到了了ICE1基因的编码序列。以双元质粒载体pMV为基础，构建了由组成型启动子CaMV35S调控的ICE1基因的植物表达载体pMV ICE1，并成功将该质粒转化根癌农杆菌EHA105，得到工程菌株。4)对影响柠檬上胚轴转化的条件进行了研究，结果表明幼嫩外植体可提高转化效率;上胚轴在农杆菌菌液中侵染7.5-30min时，转化频率没有明显的差异;在共培养培养基中加入100µM或200µM的乙酸丁香酮有利于柠檬上胚轴的转化;黑暗中短时间的预培养可提高转化的效率，长时间则提高不定芽的再生率，但降低转化效率。另外，19℃的共培养温度，5d的共培养时间，利用烟草悬浮细胞看护培养柠檬上胚轴以及在共培养培养基中添加0.2mg L(-1)的2,4-D均提高了柠檬上胚轴的转化效率。在所有处理中，转化效率最高可达到15.4%，大大高于文献报道的柠檬茎段转化效率。PCR以及Southem杂交的结果表明ICE1基因成功的整合到柠檬的基因组中，并且在柠檬基因组中以多拷贝的形式存在。在转化中共获得7个转基因柠檬植株，其中5棵移栽成活。
关键词：上胚轴, 成年态茎段, 抗寒, 农杆菌介导的转化, ICE1基因
文献注录：黄家权. 抗寒基因的克隆及根癌农杆菌介导的ICE1基因转化柑橘的研究 [D]. . 2005.
报/刊名：《》，发表于2005
文献类型： [D]
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