作者：谢亮亮
作者单位：华中农业大学
摘要：柑橘童期长达8年以上,严重阻碍了遗传育种进展,因此缩短童期有着十分重要的意义。作为柑橘类唯一的落叶果树,枳/早实枳与大多数落叶的草本植物相似,需要经过冬季低温诱导(春化作用)才能开花。FLOWERING LOCUS C(FLC)是草本植物春化途径关键基因。冬性一年生植物在秋季萌发,在冬季前由于FLC高水平表达导致成花受到抑制,在冬季时由于低温春化作用导致体内FLC的表达量降低,并拥有在春天成花的能力。本实验室前期从枳中分离了FLC同源基因Pt FLC,发现Pt FLC在不同发育时期存在选择性剪切,并分离出了五个转录本,这种调控方式与草本植物不同。为研究Pt FLC在枳/早实枳发育中的作用,本研究分别构建了Pt FLC四个转录本Pt FLCv1、Pt FLCv2、Pt FLCv3和Pt FLCv5的超表达融合载体35S::Pt FLC-GUS与35S::Pt FLC-EGFP,以期获得带有标记蛋白的转基因早实枳,进而对Pt FLC功能进行研究。主要研究结果如下:1.先后成功地构建了四个转录本超表达融合载体35S::Pt FLC-GUS与35S::Pt FLC-EGFP,通过酶切和测序验证准确无误。2.利用超表达融合载体35S::Pt FLC-EGFP进行洋葱表皮亚细胞定位,结果显示Pt FLCv1定位在细胞核,具有转录因子的特性;而Pt FLCv3则定位在细胞质和细胞核,结合前期表达模式推测Pt FLCv3可能具有更广泛的功能。3.利用超表达融合载体35S::Pt FLC-GUS进行根癌农杆菌介导早实枳上胚轴遗传转化(潮霉素筛选),目前已经得到了抗性芽。因潮霉素对植物细胞有较强的毒性,为进一步得到抗性植株,需要对潮霉素筛选体系进一步的优化与检测。4.利用超表达融合载体35S::Pt FLC-EGFP进行根癌农杆菌介导早实枳上胚轴遗传转化(卡那霉素筛选)。首先确定GFP荧光检测标准,然后通过GFP荧光检测,得到了35S::EGFP纯合子再生芽,以及部分35S::Pt FLC-EGFP的嵌合体再生芽,转基因芽目前均处在伸长培养阶段。本实验中,早实枳遗传转化总体再生率为29.9%。同时GFP荧光检测还揭示了根癌农杆菌介导上胚轴遗传转化过程中嵌合体形成过程。如何减少或避免根癌农杆菌介导的遗传转化过程中嵌合体的发生,也是今后遗传转化实验的重点之一。5.柑橘愈伤组织与烟草在验证柑橘基因功能方面研究有着巨大的优势,本研究分别通过根癌农杆菌介导的方法进行马叙葡萄柚愈伤组织与野生型烟草遗传转化(卡那霉素筛选),以获得转基因材料或者植株来研究Pt FLC功能。目前已经筛选得到了马叙葡萄柚抗性愈伤组织与烟草抗性愈伤组织和抗性芽。
关键词：成花调控 遗传转化 潮霉素 卡那霉素 GFP
文献注录：谢亮亮. PtFLC转录本超表达载体构建及遗传转化体系优化 [D]. . 2015.
报/刊名：《》，发表于2015
文献类型： [D]
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