作者：贾瑞瑞
作者单位： Cnki
摘要：柑橘溃疡病是一种由地毯黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)所引起的检疫性细菌病害,给世界柑橘产业造成巨大损失,目前还没有有效防治方法,培育抗病品种是解决柑橘溃疡病危害的根本途径。抗病基因资源发掘是抗病育种的基础,因此,本实验集合转录组数据分析和柑橘BZIP基因家族生物信息学分析,筛选到可能与柑橘抗溃疡病相关的候选基因CsBZIP40,并开展诱导表达分析、转基因功能验证,结果表明CsBZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个重要的转录因子,可为进一步抗病分子育种研究提供理论依据及抗病基因资源。本实验研究对象是在本课题组前期的转录组数据分析结合相关文献研究结果的基础上筛选到CsBZIP40。为确定CsBZIP40基因功能研究的可行性,首先利用柑橘全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据其染色体位置对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA6.0分析柑橘与拟南芥BZIP的系统发育关系,并且根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定CsBZIP40在拟南芥中同源基因的研究进展及功能。经过一系列的实验,我们从柑橘全基因组数据库中注释到47个BZIP转录因子,经BZIP家族染色体定位、结构域和系统发育分析结果显示CsBZIP40基因与拟南芥中AT1g08320同源基因,属于柑橘10个亚家族中参与病菌防御的D亚类,且AT1g08320与ROS介导的病原防御途径相关,为该基因功能研究提供理论支撑。随后,克隆CsBZIP40基因及其启动子,并进行基因序列和启动子元件分析。分析结果表明该基因序列全长5756 bp,开放阅读框长度为1530 bp,一共编码氨基酸509个,启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,例如Box-W1、HSE、ERE等。CsBZIP40含有核定位信号,通过构建GFP融合表达载体,并利用洋葱表皮亚细胞定位分析;实验证明此蛋白在细胞核内优势表达,具备转录因子发挥作用的前提。为了确定CsBZIP40的诱导表达模式,利用qRT-PCR方法分析感染溃疡病菌(Xcc)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ET)以及机械损伤(Wounding)对该转录因子的诱导表达。柑橘溃疡病菌侵染诱导表达结果表明,抗病品种四季橘中此基因上调表达,而在感病品种纽荷尔脐橙中该基因对柑橘溃疡病菌侵染没有响应,表明溃疡病菌诱导后,在纽荷尔脐橙和四季橘中CsBZIP40的表达存在差异性。本实验经研究发现外源水杨酸(SA)可使抗病品种四季橘CsBZIP40的表达水平显著上调,感病品种纽荷尔脐橙中CsBZIP40的表达水平先升后降;在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后感病纽荷尔中CsBZIP40有明显上调差异表达,抗病品种四季橘中CsBZIP40的表达水平下降,表明CsBZIP40可能是通过SA调控途径影响柑橘的品种抗性。为进一步确定CsBZIP40对柑橘溃疡病的影响,从而分析此转录因子与柑橘溃疡病抗、感的关系。通过构建CsBZIP40的超表达载体和干扰表达载体,并利用农杆菌介导法转化柑橘,我们共获得5株超表达CsBZIP40和11株干扰抑制表达CsBZIP40的转基因植株。利用离体接种溃疡病菌法,对转基因植株叶片进行抗性评价,超表达CsBZIP40的转基因植株可以明显降低柑橘溃疡病的病斑面积和病情指数,而干扰抑制表达CsBZIP40的转基因植株可以显著增加柑橘溃疡病斑的面积及病情指数。实验结果表明CsBZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个重要的转录因子,可能通过SA调节途径影响柑橘抗性,CsBZIP40的表达水平与柑橘溃疡病的抗性呈正相关关系,可以作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个重要候选基因,具有较大的应用价值。
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关键词：甜橙 柑橘溃疡病 CsBZIP40 亚细胞定位
文献注录：贾瑞瑞. 柑橘溃疡病相关转录因子CsBZIP40的功能研究 [D]. . .
报/刊名：《》，发表于
文献类型： [D]
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