作者： 祁静静
摘要：柑橘溃疡病是由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种（Xanthomonas citri subsp.Citri,Xcc）引起的细菌性病害,是危害全球柑橘产业的最严重病害之一。筛选抗病基因,培育抗病柑橘品种的分子育种已成为防治柑橘溃疡病的主要方法之一。本研究前期通过转录组数据结合溃疡病菌诱导柑橘抗、感品种的实时定量PCR（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）结果筛选得到可能与柑橘溃疡病相关的CsLYK6基因,通过反向遗传学方法进行功能验证,结合CsLYK6过表达植株的转录组、蛋白组和生理生化指标初步预测CsLYK6提高柑橘对溃疡病抗性的分子机制。主要研究结果如下:（1）CsLYK6是柑橘溃疡病潜在的抗病相关基因首先,通过抗、感溃疡病品种的转录组测序获得一个差异表达的基因CsLYK6,通过q RT-PCR再次验证发现CsLYK6在感病品种晚锦橙（Citrus sinensis,Wan Jincheng）中受溃疡病菌诱导不明显,而在抗病品种四季橘（Citrus madurensis,Calamondin）中受溃疡病菌诱导明显上调表达;预测CsLYK6可能为柑橘溃疡病抗性相关基因,四季橘可能因CsLYK6受溃疡病菌诱导后高表达而对柑橘溃疡病表现出较强抗性;其次,生物信息学分析显示CsLYK6位于柑橘6号染色体,开放阅读框为2 037 bp,编码678 aa,含有Lys M功能结构域、激酶结构域、跨膜结构域和信号肽区域;最后,通过洋葱亚细胞定位发现CsLYK6蛋白定位于细胞膜上发挥其生理功能。（2）CsLYK6过表达可增强柑橘对溃疡病的抗性构建CsLYK6过表达载体,利用农杆菌介导法转化晚锦橙,经过GUS染色、PCR和q RT-PCR检测得到3株CsLYK6过表达转基因植株;仔细观察过表达和野生型（Wild type,WT）植株叶片,发现其生长状态、叶片厚度、卷曲程度和叶片大小未有明显差异;对3个过表达植株CsLYK6的相对表达量进行测定发现,上调了49.4到69.1倍,过表达效果较显著;使用针刺法、注射法和病原菌生长曲线测定对CsLYK6过表达的转基因植株进行抗性评价,发现过表达植株的病斑大小、病情指数和生长曲线显著小于对照,病原菌生长受到明显抑制。综上所述,过表达CsLYK6明显增强了柑橘对溃疡病抗性,CsLYK6是一个溃疡病抗性相关基因。（3）CsLYK6通过CsWRKY33调控CsRBOH5介导的抗溃疡病过程分析CsLYK6过表达转基因植株的磷酸化蛋白组和转录组以挖掘其下游关键基因（蛋白）。磷酸化蛋白组数据发现CsLYK6过表达导致CsRBOH5、CsCPK13和CsMAPK6的磷酸化水平显著升高,说明CsRBOH5、CsCPK13和CsMAPK6可能在CsLYK6提高柑橘溃疡病抗性方面有重要作用。转录组数据发现活性氧相关的CsRBOH5的相对表达量也发生明显上调。过表达CsLYK6导致CsRBOH5磷酸化水平、转录水平均被明显提高,说明CsRBOH5在CsLYK6的调控下游具有重要地位。CsRBOH5上游应该有某个转录调控因子对其进行靶向和激活。为找到这个转录因子,以CsRBOH5启动子为诱饵进行柑橘酵母文库筛选,测序发现了在转录组中表达量也显著上调的转录因子CsWRKY33;进一步酵母点对点验证发现CsWRKY33可与CsRBOH5启动子区域结合并激活报告基因表达,表明CsWRKY33和CsRBOH5之间存在相互作用。据此,可推测CsLYK6可能通过调控CsWRKY33表达,激活与CsWRKY33转录因子互作的CsRBOH5来参与植物免疫过程。（4）CsLYK6过表达上调呼吸爆发氧化酶（Respiratory burst oxidase homologues,RBOH）活性和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）合成CsLYK6过表达植株蛋白组和转录组分析发现CsRBOH5的转录水平和磷酸化水平均显著上调,因RBOH是活性氧的直接来源,故进一步测定CsLYK6过表达植株中RBOH酶活、H2O2和O2·-等生理生化指标。结果发现,与对照相比,CsLYK6过表达植株RBOH酶活、H2O2和O2·-含量均明显增加。综上所述,CsLYK6是一个柑橘抗溃疡病抗性相关基因,CsLYK6过表达转基因植物明显提高柑橘对溃疡病的抗性。CsLYK6可能通过调节CsWRKY33的基因表达,调控与CsWRKY33转录因子互作的CsRBOH5的转录水平;同时CsLYK6经由CsCPK13和CsMAPK6为主要成分的磷酸级联途径,调控CsRBOH5的磷酸化水平。两条途径协同调控RBOH酶活和ROS的含量变化来增强柑橘对溃疡病抗性。
文献注录： 祁静静. 柑橘类受体激酶CsLYK6提高柑橘对溃疡病抗性的功能研究 [D]. . 2021.
报/刊名：《》，发表于2021
文献类型： [D]
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