作者：万浩亮
摘要： 柑橘种质资源丰富多样,但自然生长条件下集多优良性状的品种较少。以我国南方主要栽培品种纽荷尔甜橙（Citrus sinensis Osbeck‘Newhall’）为例,该品种鲜果香味浓郁,较耐贮藏,广受消费者喜爱,但是其果面粗糙黯淡,风味散发较快,因此果实采后打蜡增亮,套袋保鲜处理仍旧是果实商品流通过程中不可缺少环节,这不仅增加了生产成本而且加剧了‘白色污染’。利用柑橘树种丰富的自然变异,鉴定和推广集多优良品质的柑橘品种是解决这一问题的有效途径。课题组前期在赣南脐橙产区发现一例纽荷尔甜橙光亮突变体（Mutant type,MT）,与同期生长的野生型（Wild type,WT）相比,该突变体展示出多优良性状,果香更浓郁,果面更加红艳、光亮,甚至可以和打蜡后果实相媲美,田间生长和采后处理过程,MT都表现出极强的抗病性。通过216对SSR引物分析,两材料间没有发现明显差异,重测序也发现两基因组相似性达到99.78%,无明显片段增添和缺失,因此认为MT与WT遗传背景极为相似,可能是纽荷尔甜橙的芽变种。对两材料成熟期果实代谢物初步解析发现MT蜡质含量降低,茉莉酸、柠檬酸以及部分萜烯类显著增加,因此我们推测MT脂质,初生和次生代谢通路在果实发育过程中同时发生了显著变化,差异积累的代谢物最终形成了MT的多优良性状。为对突变体表型进一步解析,本课题选取WT和MT果实四个关键发育时期,花后90天（90 days after anthesis,90DAA）,150DAA,180DAA和210DAA系统地进行了脂质组学,代谢组学和转录组学分析,从转录和代谢层面阐述了MT多性状形成的机理。通过多组学分析挖掘到一个影响MT性状形成的关键ERF转录因子,对其调控蜡质和茉莉酸的功能进行了探究,取得的主要结果如下:1.突变体蜡质各组分含量降低,而总甘油脂含量升高,其中增高的叶绿体脂质又进一步激活了茉莉酸合成通路。首先确认了MT中蜡质各组分均显著低于野生型对照,尤其是醛类和醇类,进而对两材料进行四个时期的脂质测定,发现含量占比最高的三种真核叶绿体脂质,36:6单半乳糖二酰基甘油（Monogalactosyldiaclyglycerol,MGDG）,36:6双半乳糖二酰基甘油（Digalactosyldiaclyglycerol,DGDG）以及36:2磷脂酰甘油（Phosphatidyl glycerol,PG）在MT增加显著。磷脂含量的增加在转录水平也得到确认,真核脂质合成起始基因Cs FAD2（Fatty acid desaturase 2）四个发育时期都在MT中明显上调,同时上调的还有同家族的基因成员Cs FAD5,Cs FAD7。增高的叶绿体脂质诱导DAD1磷脂酶家族三个成员,Cs DAD1,Cs DAll2和Cs DAll4高表达,水解过量的叶绿体脂质,释放茉莉酸（Jasmonic acid,JA）合成原料,进一步激活通路下游LOX3,AOS,OPR等基因高表达,导致MT中高积累JA。2.MT中糖酵解和柠檬酸裂解途径被显著激活,为合成过量的脂质提供了碳源。主要的倍半萜烯类香味物质与叶绿体脂质积累模式一致,而大部分类黄酮和苯丙烷类与叶绿体脂质积累趋势相反。柠檬酸及其柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase,ACLY）,糖酵解途径关键基因:果糖激酶,果糖二磷酸醛缩酶以及3个丙酮酸激酶等都在MT中显著上调,暗示柠檬酸裂解和糖酵解两条通路为真核脂质合成提供了胞质酰基Co A原料。次生代谢检测发现,倍半萜类香味物质,瓦伦烯（Valencene）,石竹烯（Caryophyllene）以及黄酮类前体,柚皮素（Narigenin）和山奈酚（Kaempferol）在MT中显著高积累,且与36碳叶绿体脂质显著正相关,大部分被修饰的类黄酮类以及苯丙烷通路香豆素类,包括Coumarin,p-coumaric acid等在MT中含量显著降低,且与36碳叶绿体脂质显著负相关。3.一个SHN相似转录因子Cs ESE3,能够调节柑橘和番茄中蜡质以及茉莉酸合成。序列分析发现Cs ESE3与蜡质调控因子SHINE（SHN）家族成员相似,但是没有完整的‘mm’保守结构域。对比Cs ESE3与SHN成员的表达模式发现,仅有Cs ESE3在MT中持续显著下调,与降低的蜡质变化趋势一致。将Cs ESE3超表达于愈伤组织,发现蜡质和JA通路关键基因例如CER3,PLIP1,LOX3等显著高表达且JA高积累1倍以上。代谢物检测发现超表达系氨基酸含量显著增加,其中天冬酰胺增加17倍以上。将Cs ESE3基因超表达于‘Mico Tom’小番茄,发现植株抗旱能力明显强于对照,且果实表面粗糙,腺毛增长;代谢物测定发现,蜡质和JA含量同时增多,且关键基因Sl LACS1,Sl CER1以及Sl OPR3,Tom Lo XD等显著上调;次生代谢物检测发现转基因植株类黄酮含量显著积累,关键中间产物Naringenin以及Naringeninchalcone都显著增加7倍以上。Cs ESE3瞬时注射金柑果实发现,该基因也能显著提高金柑JA含量。4.CsESE3能够结合JA合成起始磷脂酶PLIP1的GCC-Box元件,并促进其表达。但是Cs ESE3不能促进MT中显著上调的三个DAD1家族成员启动子表达。烟草和金柑果实瞬时转化实验发现,甜橙DAD1和PLIP家族成员都能促进JA的合成,但是只有PLIP成员与CsESE3共表达。双荧光素酶（Dual-luciferase,Luc）实验发现Cs ESE3可以促进Cs PLIP1启动子活性达7倍以上,显著高于其它的脂质基因。酵母单杂交以及EMSA实验进一步证实Cs ESE3可以结合PLIP1基因的GCC-Box位点。Luc实验还发现Cs ESE3并不能明显促进三个MT中显著上调的DAD1家族成员启动子表达。5.Cs ESE3表达响应乙烯。连续两年检测发现,MT中乙烯含量显著低于WT,含量分别为WT的19.76%和18.63%,这与Cs ESE3在MT中低表达趋势一致。共表达分析发现Cs ESE3与催化乙烯合成的两个关键基因,ACS7和8在一个共表达模块中,且在基因前1.9K处发现一个乙烯响应元件（ATTTTAAA）,暗示该基因响应乙烯。外源乙烯处理果实两天后发现,该基因表达量相比对照显著增高5.94倍,因此,认为该基因响应乙烯,可能是甜橙中激素乙烯与茉莉酸联系的节点。
文献注录：万浩亮. 纽荷尔脐橙光亮突变体‘赣南一号’多组学分析及转录因子CsESE3调控蜡质与茉莉酸合成功能解析 [D]. . 2021.
报/刊名：《》，发表于2021
文献类型： [D]
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