作者：胡威
作者单位：湖南农业大学
摘要：农杆菌介导的柑橘遗传转化效率一直不高,为进一步提高柑橘的遗传转化效率,本研究以金柑、糖橙及柠檬实生苗上胚轴节间茎段为试材,比较系统地研究影响其再生及转化效率的各种因素,完善它了们的遗传转化技术体系。同时,在优化遗传转化技术体系的基础上,成功将“外源基因清除系统”(Gene-Deletor)以及“果实无核化”基因导入金柑和糖橙橙中,同时将YFP基因导入柠檬中。主要研究结果如下： 1金柑再生及遗传转化技术体系的建立 以35d苗龄金柑(完全暗培养)的实生苗上胚轴节间茎段为外植体,水平放置培养于不定芽再生培养基(MS+3mg·L-16-BA)上培养50d左右,不定芽再生率可达到90%；切下不定芽放置于生根培养基(1/2MS+3mg·L-1IBA+1g· L-1AC)上,不定芽生根率可达86%。 以35d苗龄(暗培养25d+光照10d)的金柑实生苗上胚轴节间茎段为遗传转化的外植体,用液体共培养培养基(MS+2mg·L-6-BA+1mg·L-1NAA+1mg·L-1KT+20mg·L-1AS, pH=5.4)重悬农杆菌菌液至OD600=0.3后,侵染30min,转入共培养基中,25℃黑暗条件下首尾相连培养3d,再转入筛选培养基(MS+3mg·L-16-BA+50mg·L-1kan+400mg·L-1cef)进行阳性芽的筛选,可获得较高的GUS阳性率。应用以上优化的遗传转化体系,成功将‘'Gene-deletor"和“果实无核化”基因导入金柑细胞中,获得23株转基因株系,转化效率可达6.07%。 2糖橙遗传转化技术体系的优化 以30d苗龄(暗培养20d+光照10d)的糖橙实生苗上胚轴节间茎段为外植体,在共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS, pH值5.7)上,19℃C共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基中,最后获得GUS阳性率为29.4%。为便于茎尖嫁接,抗性芽在伸长培养基(MS+0.2mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IAA+0.2mg·L-1GA3)上诱导伸长1个月后,95%的抗性芽出现了伸长,平均伸长产度为2.3cm。抗性芽转入生根培养基(1/2MS+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-1IBA+1g·L-1AC)中培养45d后可获得80.2%的生根率,根系平均长度为5.83cm。应用优化的遗传转化体系,将“果实无核化”基因导入糖橙细胞中,获得的7株转基因株系已嫁接于温室中,目前生长良好。 3柠檬遗传转化体系的初步研究 参照甜橙的遗传转化体系,以30d苗龄(暗培养20d后光照培养10d)的柠檬实生苗上胚轴节间茎段为外植体,农杆菌侵染时菌液OD600为0.7,侵染15min后将外植体转入共培养基(MS+3mg·L-16-BA+20mg·L-1AS, pH值5.7)上,19℃共培养条件下共培养3d后转移到筛选培养基(MS+0.5mg·L-16-BA+75mg·L-1kan+500mg·L-1cef,或MS+0.5mg·L-16-BA+10mg·L-1Basta+500mg· L-1cef, pH值5.7)中,经检测,成功将YFP基因导入柠檬细胞中,并获得5株YFP阳性芽,YFP阳性率为2.7%。
关键词：金柑,糖橙,柠檬,农杆菌,光照,共培养条件
文献注录：胡威. 农杆菌介导柑橘遗传转化体系的优化 [D]. . 2013.
报/刊名：《》，发表于2013
文献类型： [D]
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