作者：徐旋
作者单位： Cnki
摘要：柑橘是世界产量第一的水果,由于童期长、种子多胚、某些重要的商业品种育性低甚至不育等特点,利用传统的育种方法改良柑橘进展缓慢。CRISPR/Cas9系统作为近几年快速发展的基因组编辑技术可以精确有效地诱导特定的突变,特异地改造基因组,已成为植物基因功能研究和作物遗传改良的重要手段之一。利用植物原生质体瞬时转化CRISPR/Cas9系统突变得到的植株,属于非转基因种质资源,能够省去漫长的后代筛选步骤;同时相对于农杆菌介导转化柑橘上胚轴易产生嵌合体,原生质体瞬时转化CRISPR/Cas9系统是对于单个细胞进行基因编辑,得到纯合子的概率大大提高。由于柑橘原生质体瞬时转化体系尚未成熟,本研究旨在优化柑橘原生质体瞬时转化体系,提高柑橘叶肉原生质体瞬时转化效率,以充分利用亚细胞定位、双分子荧光互补(BiFC)实验对柑橘本物种基因进行功能研究;提高柑橘愈伤组织原生质体瞬时转化效率,以利用CRISPR/Cas9系统改良柑橘种质;引进3种不同的CRISPR/Cas9载体的构建体系,并利用农杆菌介导山金柑上胚轴的遗传转化法对目的基因CsP5CS2进行敲除,以期得到阳性植株用于后期的基因功能研究。实验结果包括以下几方面:1、优化柑橘原生质体瞬时转化体系。1)真空渗透酶解法缩短酶解时间,界面离心法分离纯化原生质体,去除破碎的原生质体杂质和未被完全酶解的细胞团,大大提高分离得到的原生质体的完整性及活力至90%以上;2)改变柑橘原生质体瞬时转化过程的共转化处理方式,利用37℃水浴30 min共转化处理,使柑橘叶肉原生质体瞬时转化效率由19.10%显著提高至42.04%;3)提高PEG溶液Ca~(2+)浓度至30mmol/L,37℃水浴30 min共转化处理,使柑橘愈伤组织原生质体瞬时转化效率由3.63%显著提高至13.18%。2、柑橘原生质体瞬时转化体系的应用。利用柑橘原生质体瞬时转化进行亚细胞定位实验,定位CsSPL3基因编码的蛋白于愈伤组织原生质体细胞核表达;利用柑橘叶肉原生质体瞬时转化进行BiFC实验,结果表明CsSPL14与CsARK1蛋白互作。3、CRISPR/Cas9定点突变山金柑CsP5CS2基因。以柑橘脯氨酸合成限速酶编码基因CsP5CS2为目的基因,利用CRISPR-P网站根据靶定位点设计2个gRNA,构建载体pKSE-GFP-CsP5CS2,通过根癌农杆菌介导的山金柑上胚轴遗传转化法,得到转基因阳性芽及植株,提取转基因阳性植株DNA并测序分析,结果表明,CRISPR/Cas9系统在山金柑中对目的基因CsP5CS2起到编辑作用且具有多种编辑结果,在PAM位点前3-4个碱基处产生2 bp、8 bp、50 bp缺失以及1 bp插入等情况。所得阳性植株可为于后续CsP5CS2基因功能研究。
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关键词：柑橘 CRISPR/Cas9系统 原生质体 瞬时转化
文献注录：徐旋. 柑橘原生质体瞬时转化体系优化及利用CRISPR/Cas9技术定点突变山金柑基因 [J]. . 2018.
报/刊名：《》，发表于2018
文献类型： [J]
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