作者：朱凯杰
摘要：叶绿素降解和类胡萝卜素积累是很多园艺植物果实成熟的必经过程,对果实的色泽品质起决定性作用。果实叶绿素和类胡萝卜素含量的差异使其呈现出绿色、红色、橙色、黄色、甚至棕色等。近年来,尽管我们对叶绿素降解和类胡萝卜素合成途径有了较多的研究,但关于这两条代谢途径协同调控的分子机制仍然未知。本研究以新发掘的脐橙果皮色泽突变体‘宗橙’为材料,对其棕色果皮表型及其主要品质性状进行了精细分析,采用多组学和多种遗传资源整合策略挖掘到其突变位点,并结合生化手段解析了该突变体果皮叶绿素降解受阻和类胡萝卜素积累增加的突变机制。同时探究了柑橘红色性状形成关键基因——有色体特异表达番茄红素β-环化酶（LCYb2）的等位基因酶活差异,筛选到直接调控CsLCYb2的关键转录因子,并对它们进行了系统地功能分析。主要研究结果如下:1.脐橙果皮棕色变异‘宗橙’的表型及其突变机制‘宗橙’是在湖北省宜昌市秭归县归州镇‘伦晚脐橙’果园里发现的一个果皮色泽芽变,经过选育成为新品种,其果皮呈现独特的棕色。对‘宗橙’果实常规生理指标测定发现,其果皮色差、硬度和香气与‘伦晚脐橙’不同,而其余果实品质则相同。‘宗橙’成熟果实有色层中叶绿素滞留,且类胡萝卜素积累增加,说明棕色果实形成的代谢基础是由于有色层中叶绿素和类胡萝卜素同时积累所致。‘宗橙’有色层中ABA和JA含量均显著高于‘伦晚脐橙’。破色期后‘宗橙’果实有色层中叶绿体降解受阻,至成熟期仍存在大量叶绿体,且成熟期‘宗橙’果实有色体数目相比对照明显增多,而淀粉颗粒明显减少,淀粉含量显著下降。GS-MS分析表明‘宗橙’和‘伦晚脐橙’果实有色层中大量初生和挥发性代谢物存在显著差异。采后贮藏实验发现,贮藏期间‘宗橙’果实品质总体上较‘伦晚脐橙’差。青霉菌接种侵染实验表明,相比‘伦晚脐橙’,‘宗橙’果实对青霉菌抗性更弱。通过整合多组学和和多种遗传资源的策略鉴定到了‘宗橙’的突变基因——滞绿基因STAY-GREEN（SGR）。测序发现柑橘中SGR基因存在两个等位基因（CsSGRa和CsSGRb）,与CsSGRa相比,CsSGRb由于序列变异引起的选择性剪接而提前终止,产生截短型蛋白。‘宗橙’中CsSGRa编码区的两个连续碱基发生替换形成终止密码子,使得蛋白编码提前终止(命名为CsSGRa STOP),而CsSGRb基因序列与野生型一致。烟草瞬时表达实验发现仅CsSGRa具有叶绿素降解活性,CsSGRa STOP和CsSGRb均丧失了降解叶绿素的功能,这导致了‘宗橙’果实中叶绿素无法降解。工程菌和柑橘愈伤组织转基因实验表明,CsSGRa和CsSGRb均能抑制类胡萝卜素合成,而CsSGRa STOP不具备抑制活性;Bi FC和Y2H实验证实CsSGRa和CsSGRb可直接与类胡萝卜素途径关键限速酶CsPSY1互作,而CsSGRa STOP与CsPSY1不互作;上述结果表明‘宗橙’中CsSGRa STOP通过解除对CsPSY1的抑制作用促进了类胡萝卜素的合成,使得果实中类胡萝卜素含量增加。因此,CsSGRa的变异是宗橙果皮叶绿素降解受阻、类胡萝卜素含量显著增加的直接原因,绿色和橙色叠加使其最终呈现出棕色表型。2.甜橙CsLCYb2及其互作转录因子在果实色泽形成中的功能有色体特异性LCYb2是类胡萝卜素代谢途径的关键酶,本研究在番茄中超表达2个甜橙LCYb2等位基因（CsLCYb2a和CsLCYb2b）,产生了富含β-胡萝卜素的金色番茄果实。在CsLCYb2a超表达系番茄果实中,β-胡萝卜素增加了9.3倍（1.5 mg/g干重）,且未检测到番茄红素;而在CsLCYb2b超表达系番茄果实中,β-胡萝卜素也显著增加,番茄红素显著减少但未消失;这些结果说明甜橙CsLCYb2等位基因的酶活性存在差异。进一步以CsLCYb2的启动子为诱饵进行酵母单杂筛库,成功筛选到了调控CsLCYb2的2个关键候选转录因子CsMADS3和CsERF061。CsMADS3是MADS-Box家族基因。基因表达和蛋白丰度分析表明,CsMADS3的表达水平与果实发育和色泽形成密切相关。CsMADS3是核定位的转录激活因子,能直接结合并激活CsLCYb2启动子。CsMADS3在柑橘愈伤组织中的超表达显著促进了类胡萝卜素的积累以及大部分类胡萝卜素代谢途径基因的表达,并改变了有色体的形态和激素含量。超表达CsMADS3的番茄转基因系,其果实加速褪绿且类胡萝卜素积累增加,叶绿素降解和类胡萝卜素生物合成途径中关键基因上调表达,有色体和激素显著变化。生化实验证明CsMADS3能结合并激活SGR及8个类胡萝卜素途径关键基因的启动子,包括PSY、PDS、CRTISO、BCH、ZEP、NCED、CCD1、CCD4。表明CsMADS3具有多靶点调控特性,在叶绿素降解和类胡萝卜素合成的协同调控中发挥作用。CsERF061属于乙烯响应因子家族的I亚族,其表达受乙烯诱导,且与果实成熟和着色高度相关。CsERF061是一个核定位的转录激活因子,能直接结合并激活CsLCYb2启动子。在柑橘愈伤组织和番茄果实中超表达CsERF061基因,均发现类胡萝卜素含量显著增加,类胡萝卜素代谢途径关键基因的表达上调,并伴随着有色体和激素含量的变化。生化实验证明CsERF061还能激活其它9个类胡萝卜素途径关键基因的启动子,包括PSY、PDS、CRTISO、LCYb1、BCH、ZEP、NCED、CCD1、CCD4。表明CsERF061能在乙烯介导下直接调控类胡萝卜素代谢。综上,本研究阐明了‘宗橙’突变的分子机制,揭示了SGR在调控柑果类果实成熟过程中的重要作用,并首次发现柑橘中SGR等位基因的功能分化及其在调控果实成熟过程中叶绿素降解和类胡萝卜素合成上的独特而精细的调控机制。同时明晰了CsLCYb2等位基因酶活差异,揭示了CsLCYb2互作调控因子CsMADS3对果实成熟过程中叶绿素降解和类胡萝卜素合成的协同调控作用,以及CsERF061在乙烯介导的类胡萝卜素代谢调控中的功能。该研究为未来深入解析柑果类果实叶绿素和类胡萝卜素代谢的协同调控机制奠定了基础。
关键词：柑橘; 芽变; 叶绿素; 类胡萝卜素; 贮藏性能; 滞绿基因; 番茄红素β-环化酶; 转录调控
文献注录：朱凯杰. 脐橙果皮色泽变异及番茄红素β-环化酶的调控研究 [J]. . .
报/刊名：《》，发表于
文献类型： [J]
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