作者：张书舍 周常勇 and 赵廷昌
摘要：柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是世界范围内柑橘生产上的毁灭性病害,已在50多个国家和地区发生流行,目前尚无抗（耐）柑橘品种可供商用。该病由韧皮部专性寄生的革兰氏阴性菌引起,分为亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）、非洲种（Ca.L.africanus,CLaf）和美洲种（Ca.L.americanus,CLam）,其中因CLas分布广、致病力强而被广泛研究。病原菌不可体外培养的特性制约了对HLB发病机制的研究,探究效应子功能则有助于对该机制进行解析。近年来,虽已鉴定到大量CLas效应子,但由于柑橘遗传转化周期长,对效应子与植物寄主互作的分子机制研究难以深入。此外,研究多着眼于解析单个效应子功能,而鲜有效应子间相互作用的报道。本研究基于黄龙病菌致病机理尚不明晰的现状展开研究,旨在为制定新型防治措施提供思路。利用生物信息学分析软件及本氏烟瞬时表达系统,对CLas效应子进行规模化筛选,并对2个在诱导/抑制植物防御上存在拮抗作用的效应子进行了深入的功能研究。主要研究结果如下:1.柑橘黄龙病菌效应子的筛选基于已预测的CLas效应子,通过保守性比对和理化性质分析筛选出24个候选效应子。利用马铃薯X病毒（Potato virusX,PVX）介导的本氏烟瞬时表达,对候选效应子进行规模化筛选,鉴定到致坏死效应子CLIBASIA04425（CLas4425）。此外,在筛选出的6个抑制BCL2相关X蛋白（BAX）引发坏死的效应子中,CLIBASIA00185（CLas0185）能够抑制CLas4425引起的细胞坏死。碱性磷酸酶实验证明二者具有分泌性。表达模式分析结果显示,CLas0185和CLas4425在感病柑橘中的表达水平均显著高于带菌木虱。检测感病植株不同组织中效应子表达水平发现,CLas0185在根部高表达,而CLas4425主要表达于叶片。检测传病过程中效应子在柑橘叶片的表达量发现,接菌次月即可检测到2个效应子的表达,并且CLas4425在病原菌侵染各个时期稳定表达。2.CLas0185的功能研究利用农杆菌介导晚锦橙（Citrus sinensis）上胚轴遗传转化,获得了CLas0185转基因柑橘（0185-OE）。体外针刺法接种溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc）发现,0185-OE在病斑面积和病情指数上较野生型柑橘（Wild-type,WT）显著上升。接种CLas发现,0185-OE在接菌次月感病,病原菌含量在第2、3个月显著高于WT,自第4个月起转基因和野生型植株在病原菌含量上不再有差异。观察发现0185-OE和WT在生长及表型上无显著差异,然而相较于WT,0185-OE接菌后HLB症状减轻。H2O2检测结果表明,0185-OE中H2O2含量较WT下降且不随CLas侵染而升高。检测传病4个月间病程相关基因CsPR1、CsPR2、CsPR5和韧皮部蛋白基因CsPP2表达水平发现,接菌后上述基因在0185-OE中表达水平显著低于WT。利用酵母双杂交技术在甜橙（C.sinensis）cDNA文库中筛选到49个CLas0185潜在互作靶标,通过酵母点对点、萤火素酶（Luciferase imaging assay,LCI）及Pull-down实验明确了 CLas0185与柑橘甲硫亚砜还原酶B1（Methionine sulfoxide reductase B1,CsMsrB1）存在互作。分别在 0185-OE和WT植株叶片瞬时表达CsMsrB1,免疫印迹结果显示,靶蛋白含量在转基因植株中显著上升。以转基因感病植株茎段为材料,利用发根农杆菌介导的遗传转化,获得了CsMsrB1过表达（0185+CsMsrB1-OE）和沉默（0185+CsMsrB1-RNAi）的转基因毛状根。TaqMan qPCR 检测根部 CLas含量发现,相较于对照组,病原菌含量在CsMsrB1过表达毛状根中显著增加,而在CsMsrB1沉默毛状根中显著降低。在柑橘中瞬时表达CsMsrB1导致H2O2含量降低,而利用柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf bltch virus,CLBV）介导的CsMsrB1沉默植株体内H2O2含量显著上升。进一步研究发现,CsMsrB1与柑橘抗坏血酸过氧化物酶1（Ascorbate peroxidase 1,CsAPX1）间存在互作。竞争性 Pull-down 结果表明,CLas018 不影响CsMsrB1与CsAPX1的结合。氧化还原反应及酶活检测结果表明,CsMsrB1能够稳定CsAPX1还原态及活性。瞬时表达CsAPX1的柑橘体内APX活性上升而H2O2含量降低,利用CLBV介导CsAPX1沉默植株体内APX活性降低而H2O2含量升高。以野生型感病植株茎段为材料,获得了CsAPX1过表达（CsAPX1-OE）和沉默（CsAPX1-RNAi）的转基因毛状根。TaqMan qPCR检测根部CLas含量发现,相较于对照组,病原菌含量在CsAPX1-OE毛状根中显著上升,而在CsAPX1-RNAi毛状根中显著降低。酶活检测结果表明,CLas0185转基因植株中APX活性上升,且在接菌前后无差异;相较于对照组,APX在CsMsrB1瞬时表达植株中活性增强,CLBV介导的沉默植株中活性被削弱。3.CLas4425的功能分析由于效应子CLas0185能够抑制CLas4425引发的本氏烟叶片坏死,为了验证二者是否作用于相同的寄主靶标,本研究检测了 CLas4425与CLas0185靶蛋白CsMsrB1的互作情况。酵母点对点结果显示二者不存在互作。然而,利用酵母双杂交技术筛选C.sinensis cDNA文库未能鉴定到与CLas4425互作的蛋白。亚细胞定位结果表明,CLas4425定位于细胞质膜,并且定位决定其致坏死活性。利用本氏烟脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默发现,该效应子引发的细胞坏死依赖于胞质类受体激酶 NbBIK1（Botrytis-induced kinase 1）。本氏烟中表达CLas4425 促进了丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato）的增殖。qRT-PCR结果显示,该效应子抑制了水杨酸（Salicylic acid,SA）通路基因NbEDS1、NbNPR1和NbPR2的表达。利用农杆菌介导的遗传转化,获得了 CLas4425转基因柑橘（4425-OE）。体外针刺接种Xcc发现,4425-OE在病斑面积和病情指数上较WT显著上升。接种CLas发现,4425-OE在接菌首月感病,病原菌含量在第2、3个月显著高于WT,自第4个月起转基因和野生型植株在病原菌含量上不再有差异。观察发现,4425-OE和WT植株在生长及表型上无显著差异,接菌后转基因植株HLB症状加重。检测柑橘中CsPP2、葡萄糖转运基因CsAPS1及淀粉合成基因CsGBSS1和CsSS1的表达水平发现,CLas4425促进了CsPP2和CsAPS1的表达。质谱分析和qRT-PCR检测发现,4425-OE中SA含量及该通路基因CsEDS1,CsNPR1和CsPRs的表达水平较WT显著降低。对本研究鉴定到的2个效应子进行功能分析发现,二者均可促进CLas在柑橘体内增殖。CLas0185通过提升柑橘中CsMsrB1含量以维持植物体内抗氧化物酶活性从而抑制ROS积累,揭示了 CLas效应子抑制宿主免疫的新机制。CLas4425一方面被植物识别引发本氏烟防御反应,另一方面通过抑制植物体内SA积累及该通路基因的表达从而削弱寄主免疫
文献注录：张书舍 周常勇 and 赵廷昌. 柑橘黄龙病菌效应子CLIBASIA＿00185和CLIBASIA＿04425的功能研究 [J]. . 2024.
报/刊名：《》，发表于2024
文献类型： [J]
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